人参皂苷Rh2对人肝癌Bel-细胞增殖和凋亡的影响
何鑫，何剪太，张阳德
（中南大学卫生部肝胆肠外科研究中心，湖南长沙）
摘要：目的观察人参皂苷Rh2对人肝癌Bel-细胞增殖和凋亡的影响，并初步研究其机制。方法将Bel-细胞与人参皂苷Rh2（、和50μg/mL）共同培养48h。MTT法检测人参皂苷Rh2对Bel-细胞增殖的影响；流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数；TUNEL技术检测其对Bel-细胞凋亡的影响；Westernblotting法检测Bel-细胞中Bcl-2、Bax的蛋白表达。结果MTT结果显示，人参皂苷Rh2能抑制Bel-细胞的生长；流式细胞检测显示，人参皂苷Rh2能使细胞停滞于G1期；TUNEL结果显示，人参皂苷Rh2能有效诱导Bel-细胞凋亡；Westernblotting结果显示，人参皂苷Rh2能上调Bel-细胞中Bax的表达，下调Bcl-2的表达。上述结果均在一定程度上呈量效关系。结论人参皂苷Rh2能抑制Bel-细胞生长并促进其凋亡，其作用机制可能为上调Bax和下调Bcl-2。
关键词：人参皂苷Rh2；Bel-细胞；增殖；凋亡
中图分类号：Q文献标识码：A
在全球范围内，肝癌的发病率居高不下，已严重威胁到人类的生存与健康。因此，积极寻找针对肝癌的特效、低毒性药物已刻不容缓。尽管肝癌的发病机制尚未完全明确，但大量研究表明，细胞增殖与凋亡的失调是导致癌症发生的关键因素。
目前，从植物中筛选出活性成分用于治疗肝癌，已逐渐成为中药发展的重要途径。人参皂苷是人参中主要的药效成分，具有较强的抗癌活性，且因细胞毒性低而很少产生不良反应[1]。人参皂苷-Rh2对各类癌症有一定的治疗效果。药代动力学研究发现，人参皂苷Rh2主要分布于肝脏和胃肠道[2]。从机制上看，人参皂甙Rh2能通过Caspase信号通路诱导人黑色素肿瘤细胞产生凋亡[3]；还能通过线粒体途径诱导结肠癌细胞凋亡[4]。
本研究旨在探讨人参皂苷Rh2对人肝癌Bel-细胞增殖和凋亡的影响，为肝癌相关的新药研发和临床治疗提供一定的理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株人肝癌Bel-细胞株购自中国科学院上海细胞研究所。
1.1.2试剂与耗材99%纯度的人参皂甙Rh2购自上海融禾医药科技发展有限公司；高糖DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶购自美国Gibco公司；MTT购自美国Sigma公司；各种型号的细胞培养皿、培养板、注射器购自美国BD公司；蛋白定量试剂盒购自美国PIERCE公司；anti-GAPDH、anti-Bcl-2、anti-Bax的一抗，以及anti-rabbit、anti-mouse的二抗均购自美国SantaCruz公司；WB显影液、WB定影液购自日本Kodak公司。
1.1.3仪器超净工作台购自苏州安泰公司；台式小离心机购自德国Eppendorf公司；紫外分光光度仪购自美国Beckman公司；型细胞培养箱购自日本三洋公司；倒置相差显微镜购自日本Nikon公司；CO2细胞培养箱购自英国RSBiotech公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养将人肝癌Bel-细胞用含10%FBS的DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养。每2天换液1次，细胞生长至80%时用胰酶进行消化传代。
1.2.2MTT法检测人参皂甙Rh2对细胞增殖的影响取对数生长期的Bel-细胞用胰蛋白酶消化，以1×个/孔接种于96孔培养板，每孔接种μL，用含10%FBS的DMEM培养基培养。当细胞长至30%时，更换为无血清的DMEM培养基，实验组分别加入人参皂甙Rh2并调整其终浓度为、和50μg/mL，阴性对照组则不加人参皂甙Rh2。在37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，加入MTT（10g/L）10μL/孔，继续孵育4h形成结晶。弃培养液，加入μLDMSO，振荡至结晶充分溶解。用酶标仪检测nm波长处吸光度值（OD）（重复检测3次求平均值）。按公式计算细胞生长的抑制率：抑制率（％）=（阴性对照组OD-实验组OD）/阴性对照组OD。
1.2.3流式细胞仪分析细胞周期分布取对数生长期的Bel-细胞，按照1×个/mL接种于6孔细胞培养板内，每孔接种2mL。置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h后进行细胞换液，更换为含1%FBS的DMEM培养基。放回培养箱中继续培养12h，使细胞进入静止期。实验组分别加入人参皂苷Rh2，使终浓度分别为、和50μg/mL，阴性对照组则不加人参皂苷Rh2。放回温箱继续培养24h后收集细胞，r/min离心8min。用4℃预冷的μLPBS重悬细胞，并缓慢加入μL预冷的乙醇以悬浮固定细胞，4℃过夜。检测前用PBS洗涤细胞2次。每一样本中加入μLRNase，37℃孵育15min。再加入μL碘化丙啶，室温下避光5min。利用流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数。
1.2.4TUNEL技术检测细胞凋亡取对数生长期的Bel-细胞用胰蛋白酶消化，以1×个/孔接种于事先放置无菌玻片的24孔板，每孔加入1mL。在37℃、5%CO2培养箱中培养24h，向实验组中加入人参皂甙Rh2，并调整其终浓度分别为、和50μg/mL，阴性对照组则不加人参皂甙Rh2。37℃、5%CO2培养箱中继续培养48h，取出玻片，PBS漂洗2次，用4％多聚甲醛固定30min，PBS洗1次后自然风干。将玻片置于于冰上，加入含0.1％TritonX-、0.1％枸橼酸钠的渗透液，浸润5min，PBS洗3次。滴加50μLTUNEL反应液（45μLTdT反应液+5μL荧光素标记的dUTP），37℃水浴共孵60min。用中性树胶封片。阳性对照：细胞玻片先用DNaseI缓冲液预处理10min，再按上述步骤进行TUNEL染色。阴性对照：以50μL荧光标记液代替TUNEL反应液。
利用荧光显微镜，在～nm波长范围激发荧光，并以细胞核出现强烈荧光作为判断TUNEL阳性细胞的标准。每张玻片随机观察10个高倍视野（×），按下列公式计算细胞凋亡率（％）。凋亡率（％）=TUNEL阳性细胞/全部细胞×%
1.2.5Westernblotting检测取对数生长期的Bel-细胞，向实验组中加入人参皂甙Rh2，并调整其终浓度分别为、和50μg/mL，阴性对照组则不加人参皂甙Rh2。在37℃、5%CO2培养箱中培养48h，收获细胞。提取细胞总蛋白，并进行蛋白定量。取等量样本行10%的SDS-PAGE电泳分离，然后将蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜在封闭液中封闭2h，分别用Bcl-2、Bax和GAPDH的一抗进行孵育，4℃过夜。PBST洗1次后，用相应的二抗室温孵育40min。用PBST洗8次，每次5min。在暗室中，向PVDF膜上加入适量显色底物，显影5min。
1.3统计学方法
采用SPSS10.0软件完成统计学处理，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间分析比较采用t检验，P0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1人参皂苷Rh2对Bel-细胞增殖的影响
将不同浓度的人参皂苷Rh2（、和50μg/mL）与Bel-细胞共培养48h后，发现与阴性对照组相比，实验组Bel-细胞的增殖受到明显的抑制，且抑制效果随人参皂苷Rh2浓度增高而加强。可见，人参皂苷Rh2对Bel-细胞的增殖有抑制作用（见表1）。
2.2人参皂苷Rh2对Bel-细胞周期各时相的影响
将不同浓度的人参皂苷Rh2（、和50μg/mL）与Bel-细胞共培养48h后，发现与阴性对照组相比，各浓度人参皂苷Rh2的实验组中G0/G1期细胞比例显著增高，且呈现一定的量效关系，与之对应的是S期的细胞比例显著降低，而各组G2/M期的细胞比例没有显著差别。可见，人参皂苷Rh2能有效地将人肝癌Bel-细胞阻滞在G1期，从而影响其增殖（见表2）。
2.3人参皂苷Rh2对Bel-细胞凋亡的影响用不同浓度的人参皂苷Rh2处理肝癌Bel-细胞48h后，在荧光显微镜下进行观察，凋亡细胞核呈较强荧光，部分细胞核破裂，出现不规则的碎片。与阴性对照组相比，各种浓度的人参皂苷Rh2均能有效诱导Bel-细胞凋亡，且呈显著的量效关系（见表3）。
2.4人参皂苷Rh2对Bel-细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响
用不同浓度的人参皂苷Rh2处理人肝癌Bel-细胞48h后，提取细胞总蛋白进行Westernblotting检测。与阴性对照组比较，各浓度的人参皂苷Rh2均能降低Bel-细胞中Bcl-2蛋白的表达水平，并提高Bax蛋白的表达水平，并呈一定的剂量依赖关系（见附图）
3讨论
肝癌是威胁人类生存健康的恶性疾病，其发生和发展是由各种调控信号异常导致的。当前已有大量实验表明，通过影响细胞周期并诱导细胞凋亡，能有效控制肿瘤细胞的增殖[5-8]。因此，在临床治疗方面，针对癌细胞周期的调控以及诱导癌细胞凋亡是抗癌药物研发的重要思路。本研究证实，不同浓度的人参皂苷Rh2能有效抑制人肝癌Bel-细胞的增值，并促进其凋亡，且效果随着人参皂苷Rh2浓度的增加而逐渐增强。可见，人参皂苷Rh2对临床治疗肝癌具有潜在的应用前景。
此前有研究发现，人参皂苷Rh2可以调控细胞周期中G1/S期阻滞点，从而引发G1期阻滞。例如，人参皂苷Rh2通过调控Cyclin-D1、Cyclin-E、CDK6等细胞周期调节蛋白，引起人肺癌A细胞G1期生长阻滞[9]。本研究发现相对于阴性对照，不同浓度的人参皂苷Rh2能使人肝癌Bel-细胞停滞于G1期，且呈现一定的剂效关系。因此，进一步证实了人参皂苷Rh2抑制癌细胞的机制之一是通过影响细胞周期实现的。
除了阻滞细胞周期外，诱导细胞凋亡也是治疗癌症的有效手段。所谓细胞凋亡是指生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。
研究表明，多种基因参与调控细胞凋亡过程，其中Bcl-2和Bax发挥了重要作用[10]。具有抗凋亡作用的Bcl-2处于细胞凋亡调控机制的末端，参与维持细胞分化与数量的动态平衡，是哺乳动物细胞最关键的凋亡调控因子。而Bax具有促凋亡作用，能与Bcl-2形成异源二聚体，共同调控细胞凋亡。事实上，在不同的生理或病理状态下，Bcl-2和Bax自身的表达量变化很大，而且两者对细胞凋亡的调控作用不仅取决于自身的表达，还取决于两者表达的比例[11-12]。本研究结果表明，与阴性对照组相比，用不同浓度的人参皂苷Rh2处理人肝癌Bel-细胞48h后，细胞中具有抗凋亡作用的Bcl-2表达下降，而促凋亡的Bax表达升高，这也引起了Bcl-2/Bax比值降低。因此，本实验结果提示人参皂苷Rh2诱导Bel-细胞凋亡的作用可能是通过影响Bax、Bcl-2表达来实现的。
总之，本研究发现，人参皂苷Rh2能有效抑制人肝癌Bel-细胞的增殖，并能诱导其凋亡，因而在临床治疗肝癌方面有广泛的应用前景。不仅如此，本研究进一步证明了其作用机制至少涉及两方面内容，一是细胞周期阻滞，二是Bel-2和Bax参与调控细胞凋亡。相信随着研究的深入，人参皂苷Rh2在癌症治疗方面的应用价值将逐渐展现出来。
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